ELISA实验结果常见问题：显色淡灵敏度偏低

ELISA实验结果常见问题及解决方案——显色淡灵敏度偏低

当完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色，发现酶标板中孔的显色比较浅，只有微弱的信号呈现，可能的原因及解决方法：
 

序号	可能原因	解决方法
1	试剂盒未充分平衡	试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，   确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。
2	样品不适合做ELISA检测	样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适   合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）。
3	酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥	防止板过于干燥。
4	包被抗体遭到破坏	操作温和，移液枪不能碰到孔底。
5	样本和抗体孵育条件不合适	按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。
6	洗涤浸泡时间过长	按照说明书操作，勿人为增加浸泡时间。
7	偶联HRP试剂污染	弃去试剂，重新配置。
8	错误的稀释偶联HRP试剂	弃去试剂，重新配置。
9	TMB底物孵育时间过短，因非人为因素  影响，需要优化孵育时间	确定合适的孵育时间：人为判定-最高浓度S1出现深蓝色，S4-5   有淡蓝色。或机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65。
10	样本浓度过高或存在基质效应	建议做不同稀释倍数，确认样本最佳稀释倍数。
11	酶标仪滤光片设置有问题或者波长选  择不对	确认仪器设置及选择正确的波长检测。
12	酶标板不适合做ELISA	不能使用细胞培养板，建议使用ELISA专用高吸附力板子。

 

总结为避免显色淡灵敏度低，需注意以下几点：

1、 常规ELISA试剂盒平衡至30min；

2、 检测抗体、偶联HRP请按说明书稀释比；

3、 样本、抗体孵育条件（温度、转速），请根据说明书；

4、 控制TMB底物显色时间。