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细胞因子及其受体的检测

发布时间:2020-06-11 17:56 |  点击次数:

细胞因子及其受体的检测

细胞因子在机体免疫应答过程中起着十分重要的作用。在某些疾病时,体内细胞因子及其受体表达可发生异常,与机体免疫功能低下或发生病理损伤有关。因此,在临床免疫学中越来越重视对细胞因子及其受体的检测。在基础免疫研究中,常需检测不同条件培养液中细胞因子的活性,并探讨细胞因子产生水平与免疫细胞表型、增殖、杀伤及其它功能的关系。此外,原核细胞和真核细胞中表达的重组细胞因子或经过不同工艺纯化后的产品需测定其活性和含量。

从细胞因子及其受体检测的水平来说,可以分为基因组DNA、mRNA和蛋白三个不同的水平,后者又包括胞浆内、膜表面以及分泌到体液或培养上清等三种不同形式细胞因子。目前应用最多的是检测体液或培养丰清中的细胞因子以及膜表面的细胞因子受体。

一、生物活性检测法

细胞因子生物学活性检测法是根据某些细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示系统和标准品来反映待测标本中某种细胞因子的活性水平,一般以活性单位来表示。生物学检测法一般敏感性较高,直接表示待测标本中的活性水平。但实验周期较长,如集落形成法需10~14;易受细胞培养中某些因素的影响,如血清、pH、药物;易受生物学活性相同或相近的其它细胞因子的影响,如检测IL-2时可受IL-4的干扰,TNF-α和TNF-β(淋巴毒素)表现出极为相似的生物学作用;易受待栓样品中某些细胞因子抑制物的干扰,如IL-1活性可被IL-1受体拮抗物(IL-1ra)所抑制,TNF-α可被TNF-BP所阻断;不能区分某些细胞因子的型和亚型,如IFN-α、β和γ,以及IFN-α中不同的亚型显示相同的生物学活性;某些指示细胞长期培养易发生突变;不同指示细胞对同一种细胞因子的敏感性不同,所慕名而来结果难于标准化;此外,某些人源的细胞因子如hIL-2对小鼠细胞起作用,但鼠源性的IL-2对人的细胞则无刺激作用。

生物学检测的方法大致可分为增殖或增殖抑制、集落形成、直接杀伤靶细胞、保护靶细胞免受病毒攻击、趋化作用以及抗体形成法等几类。

(一)增殖或增殖抑制法

其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些指示细胞的增殖,通过3H-TbR掺入或MTT法显色,反映待检细胞因子的活性水平。

(二)集落形成法

其基本原理是应用骨髓干细胞体外半固体培养系统,根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种或某些种类细胞的集落,通过对形成集落形态学、酶学鉴定,计算不同种类集落形成的数量和比例,反映待测标本中CSF的种类和活性水平。

(三)直接杀伤靶细胞

在细胞因子中TNF-α、TNF-β具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用,采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929,以及WEHI164亚克隆13作为指示细胞,通过3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。

(四)保护靶细胞免受病毒的攻击

靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡,干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击,常用的病毒是水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV),敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜的上皮细胞WISH,通过干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)抑制病毒致病变的程度,计算出待测样品中IFN的活性单位。

(五)趋化作用

IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用,可用小室法或软琼脂趋化法,PMN或淋巴细胞作为指示细胞,以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。

(六)抗体形成法

IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生和分泌免疫球蛋白,常用的指示细胞有分泌IgG的ARH-77、CESS和分泌IgM的SKW6.CL-4。在一定的条件下,待检样品中IL-6水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正相关,通过标准IL-6的对照可推算出待检样品中IL-6的活性。

表4-22 细胞因子生物学活性检测方法(举例)

 

被检细胞因子 实验系统 可干扰的因素
IL-1 D.10(小鼠T细胞) 增殖法(3H-TdR、MTT) 人IL-2;小鼠IL-2、IL-4、IL-7、GM-CSF、TNF等
  小鼠胸腺细胞 增殖法 TGF-β1、β2抑制作用
  IL-4(小鼠胸腺瘤) CTLL转换法(增殖法) 小鼠IL-4
  黑素瘤细胞A352 增殖抑制法  
IL-2 CTLL(小鼠杀伤性T细胞系) 增殖法 小鼠IL-4
IL-3 KG1(髓样白血病细胞) 增殖法  
  TF-1(前髓样细胞) 增殖法 EPO、IL-5、IL-6、GM-CSF
  小鼠造血细胞系FDCP-1 增殖法 GM-CSF
  人巨核母细胞白血病细胞系Mo7E 增殖法 GM-CSF、IL-9
  骨髓半固体造血祖细胞集落形成 20α类固醇脱氢酶 GM-CSF
    集落种类和数量 GM-CSF、IL-1、IL-6、G-CSF、M-CSF
IL-4 小鼠B细胞 诱导CD23、MHCⅡ类 IFN-γ有抑制作用
    抗原表达  
  PHA刺激的小鼠T细胞 增殖法 IL-2
  IL-4依赖细胞株 增殖法 IL-2
  人IL-4R转染CTLL 增殖法 IL-2

 

续表1

 

被检细胞因子 实验系统 可干扰的因素
IL-5 抗Ig(或SAC)刺激B细胞诱导人或小鼠骨髓半固体培养中嗜酸性粒细胞成熟 增殖法 IL-3
  抗Ig处理的小鼠B细胞 IgM分泌  
  BCL-1(B淋巴瘤细胞) 增殖法 IL-4
IL-6 TF-1(前髓样细胞) 增殖法 EPO、IL-3、IL-5、GM-CSF
  B9(小鼠杂交瘤细胞) 增殖法 小鼠IL-4、IL-11
  7TD1(小鼠杂交瘤细胞) 增殖法 IL-11
  BM60 增殖法  
  HepG2(肝细胞) Fibronogen产生 LIF
  CESS(EBV转化人B细胞)   IgGβ1、TGF-β2有抑制作用
  DKW6.CL-4 IgM产生 TGFβ1、TGF-β2有抑制作用
IL-7 骨髓前B细胞 增殖法  
IL-8 中性粒细胞 软琼脂趋化法 其它化学趋化物质
    小室趋化法 G-CSF、M-CSF
IL-9 Mo7E(巨核细胞白血病系) 增殖法 IL-3、GM-CSF
IL-11 7TD1(小鼠杂交瘤细胞系) 增殖法 IL-6
  B9(小鼠杂交瘤细胞系) 增殖法 小鼠IL-4、IL-6
  T1165 增殖法 IL-6
IL-12 PBMC IFN-γ产生 IFNα/β/γ
  PHA活化T淋巴母细胞 增殖法 IL-2、IL-4
  PBL LAK杀伤(与IL-2协同) IL-2、IL-6
  骨髓祖细胞 GM集落形成 IL-3;TGF-β有抑制作用
  TF-1(前髓样细胞) 增殖法 EPO、IL-3、IL-5、IL-6
  小鼠造血细胞FDCP-1 增殖法 IL-3
  人巨核母细胞白血病细胞系Mo7E 增殖法 IL-3、IL-9
  AML-193 增殖法  
  造血祖细胞 粒细胞集落形成 IL-3、IL-9
  中性粒细胞 活化后超氧释放 GM-CSF
  WEHI164亚克隆13或L929 杀伤作用 GM-CSF、IL-6
      TNF-α和TNF-β(LT)有相似的杀伤作用

 

续表2

 

被检细胞因子 实验系统 可干扰的因素
PDGF 成纤维细胞和SS、WHG、WI26、WI28 增殖法 FGF(1、2、5)、EGF、TGF-β、IL-1、TNF等
INF-α/β/γ 上皮细胞如Hep-2、Wish 抵抗病毒(如VSV)的致病变作用 FN-α/β/γ有相似的生物学活性
TGF-β 成纤维细胞(半固体培养) 增殖法  
  成骨细胞单层培养 增殖法  
  PHA刺激PBMC 增殖抑制法  
  ConA/IL-1诱导胸腺细胞 增殖抑制法 IL-2、IL-4
  人黑素瘤细胞A375 增殖抵制法 IL-1、IL-2、IL-4