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实验专栏 | 手把手教你质粒DNA提取

人阅读 发布时间:2021-09-27 10:28

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上面这张图,大家有没有一种熟悉的感觉,没错,就是你想的核酸提取实验流程图。

相信大家作刚开始做为实验小白,刚进实验室时,学的第一个实验就是提质粒了。当时刚进实验室,看着师兄做实验的样子好酷呀!

跟在师兄后面,认真的对每一步的步骤都做好笔记,后来才发现你只不过是做了一份手抄版的说明书。

接下来的N年里,除了转化、涂板、挑单克隆、摇菌、提质粒、酶切、连接,此时此刻,只想有个提取质粒的机器人。因为做多了之后,你就会像个机器人一样,最后甚至连提取的原理都会遗忘了。所以,今天小编就来给大家讲一讲提取质粒的原理,以及操作步骤等。

 

质粒提取原理

 

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外,质粒DNA上携带了部分的基因信息,经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

 

质粒DNA提取的应用

 

(1)快速纯化质粒;

(2)用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

 

提取质粒的基本步骤

 

(1)细菌的培养和质粒的扩增

(2)细菌菌体的裂解

(3)质粒DNA的纯化

一、

摇菌培养

1. 将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。(一种培养基,使质粒扩增)。

2. 置于37℃恒温培养箱,培养12-17h,待长出菌落。

3. 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基,编号标记。

4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基,每个培养基放置1个菌落。

5. 37℃,180rpm,振荡培养过夜。

二、

收获细菌并裂解

1.离心扩增好的菌液,按说明书将菌液重悬,转入1.5ml离心管中。

2.用质粒小量抽提试剂盒,按说明书要求提取质粒。

3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。

4.加入250ulRB溶液,振荡器充分悬浮细菌。

5.加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次,使细菌裂解,室温,放置2min。

6.加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次,使之充分中和,室温,放置2min。

7.室温,1500rpm,高速离心15min。

 

8、将吸附柱放入收集管内,离心得到的上清转移至吸附柱,室温,15000rpm,高速离心30s。

9、弃废液,将吸附柱放入收集管,加入700ul WB溶液到吸附柱中,15000rpm,高速离心30s。

10、重复上一操作。

11、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中,加30-50ul预热的Elution Buffer,室温,放置2min,高速离心1min。

12、样品进行电泳检测:1%琼脂糖凝胶电泳,上样量为2ul,紫外灯下观察,最明亮的带为超螺旋形式,可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

三、

质粒的纯化

1. 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中,加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。

2. 加入2倍体积的无水乙醇,放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。

3. 4℃,高速离心机14000rpm,离心20min.

4. 弃去上清,70%乙醇洗2次。

5. 空气干燥,可置超净工作台干燥。

6. 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀,即为质粒溶液。

7. 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

测量OD260和OD280的值:质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数(μg/mL)。

 

质粒提取的方法

 

质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚陆仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。

01

碱裂解法

此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:

1.接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2.37°℃振荡培养过夜。

3.取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。

4.加加o.1lm1溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mML Tris-HC1 pH8.0)充分混合。

5.加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),车轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。

6.加入0.15m1预冷溶液III(5 molLKAc, pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。

7.以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管

8.加入等体积的一戊醇,混匀后于0℃静置10min。

9.再以10,000rpm离心20min,弃上清。

10.用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。

11.待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中

02

煮沸法

1.将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4C下12000g离心30秒。

2.弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。

3.将菌体沉淀悬浮于120m1 STET溶液中,涡旋混匀。

4.加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡3秒钟。

5.将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6.用微量离心机4C下12000g离心10分钟。

7.用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8.取20ml进行电泳检查。

03

酚陆仿裂解法

1.从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆,接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 ug/mL)摇菌12 h;收集1.5 mL菌液,8000 g/min离心3 min,弃上清,沉淀加入200 _uL TE,充分混匀;加入400 uL酚陆仿(1 : 1体积)混合液,剧烈振动10 s,混匀;12 000g/min离心5 min,1 mL胰岛素注射针收集上清,尽量避免吸入蛋白沉淀层;上清经国产0。22 um针式滤器过滤1次;向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇,振荡10 s,12 000 g/min离心5 min;沉淀溶于20uL的RTE溶液中,37°℃水浴。

2.按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37°C,1h)。酶切产物10 uL,10 g/L琼脂糖凝胶电泳。

3.PCR引物根据参考文献〔1〕设计,预计扩增产物片断大小为714 bp。

4.常规制备感受态菌E。coli DH5a,提取质粒DNA常规转化感受态,涂于含有卡那霉素(30 umL)LB培养平板中,37C培养,15 h后观察筛选克隆情况。

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