上面这张图，大家有没有一种熟悉的感觉，没错，就是你想的核酸提取实验流程图。

相信大家作刚开始做为实验小白，刚进实验室时，学的第一个实验就是提质粒了。当时刚进实验室，看着师兄做实验的样子好酷呀！

跟在师兄后面，认真的对每一步的步骤都做好笔记，后来才发现你只不过是做了一份手抄版的说明书。

接下来的N年里，除了转化、涂板、挑单克隆、摇菌、提质粒、酶切、连接，此时此刻，只想有个提取质粒的机器人。因为做多了之后，你就会像个机器人一样，最后甚至连提取的原理都会遗忘了。所以，今天小编就来给大家讲一讲提取质粒的原理，以及操作步骤等。

 

质粒提取原理

 

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

 

质粒DNA提取的应用

 

（1）快速纯化质粒；

（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

 

提取质粒的基本步骤

 

（1）细菌的培养和质粒的扩增

（2）细菌菌体的裂解

（3）质粒DNA的纯化

一、

摇菌培养

1. 将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。（一种培养基，使质粒扩增）。

2. 置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。

3. 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。

4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。

5. 37℃，180rpm，振荡培养过夜。

二、

收获细菌并裂解

1.离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。

2.用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。

3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。

4.加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。

5.加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。

6.加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。

7.室温，1500rpm，高速离心15min。

 

8、将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。

9、弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。

10、重复上一操作。

11、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的Elution Buffer，室温，放置2min，高速离心1min。

12、样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，最明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

三、

质粒的纯化

1. 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。

2. 加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。

3. 4℃，高速离心机14000rpm，离心20min.

4. 弃去上清，70%乙醇洗2次。

5. 空气干燥，可置超净工作台干燥。

6. 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。

7. 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

测量OD260和OD280的值：质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数（μg/mL）。

 

质粒提取的方法

 

质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚陆仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。

01

碱裂解法

此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:

1.接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2.37°℃振荡培养过夜。

3.取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4.加加o.1lm1溶液I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0,25mML Tris-HC1 pH8.0)充分混合。

5.加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1% SDS)，车轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6.加入0.15m1预冷溶液III(5 molLKAc, pH4.8),轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7.以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8.加入等体积的一戊醇，混匀后于0℃静置10min。

9.再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10.用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11.待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中

02

煮沸法

1.将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4C下12000g离心30秒。

2.弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3.将菌体沉淀悬浮于120m1 STET溶液中，涡旋混匀。

4.加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，涡旋振荡3秒钟。

5.将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6.用微量离心机4C下12000g离心10分钟。

7.用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8.取20ml进行电泳检查。

03

酚陆仿裂解法

1.从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 ug/mL)摇菌12 h;收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 _uL TE，充分混匀;加入400 uL酚陆仿(1 : 1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀;12 000g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层;上清经国产0。22 um针式滤器过滤1次;向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s,12 000 g/min离心5 min;沉淀溶于20uL的RTE溶液中，37°℃水浴。

2.按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37°C，1h)。酶切产物10 uL,10 g/L琼脂糖凝胶电泳。

3.PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714 bp。

4.常规制备感受态菌E。coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素(30 umL)LB培养平板中，37C培养，15 h后观察筛选克隆情况。