细胞的活性鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。它是体外细胞培养技术中常用的一个检测指标。不同的细胞活性鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用哪种方法，都利用了死细胞和活细胞在生理机能和性质上的差异。常用的方法有直接染色法，克隆形成试验，比色法等。

下面我们就简单的了解一下常用的细胞活性检测方法的原理，特点，以及各自的优缺点。

 一、染色计数法 

1. 化学染色法

   染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法,直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力,检查细胞活性,能在光学显微镜下观察到染色结果.可分为两类:死细胞着色法和活细胞着色法.使死细胞着色的常用染料有台盼蓝,苯胺黑,伊红Y.能使活细胞着色的常用染料有结晶紫,亚甲基蓝,甲本胺蓝等.其中最常用的是台盼蓝染色法….细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的细胞膜,与解体的DNA结合,使其着色,而活细胞能阻止染料进入细胞内,故可以鉴别死细胞与活细胞.通过细胞计数可得出细胞的存活率.

   优点：方便实用，价格低廉，操作简单

   缺点：时间不宜过长,否则部分活细胞也会着色,会干扰计数.而且,细胞没有经过固定,形态不清晰.

    

2. 荧光染色法

   一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果,利用荧光显微镜检测细胞活性.如碘化丙锭。(PI),被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜,因此活细胞不被染料染上色,只有死细胞或是凋亡细胞才能染上红.色.叶啶橙(AO)能透过质膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA,使之发出明亮的绿色荧光.溴化乙锭(EB)仅能透过胞膜受损的细胞,嵌入核DNA,发橘红色荧光.也可应用AO—EB双染法鉴定细胞死活.

   优点：这种检测方法相比传统的染料,具有灵敏度高,操作简便,结果容易分辨等特点,而且利用双染法还可以分辨活细胞,凋亡早期细胞,凋亡晚期细胞,死亡细胞，在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。

   缺点：要求特殊的仪器进行检测,如荧光显微镜,激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪.而且通常荧光染料具有毒性,操作作时需要带手套.

 二、克隆形成试验 

克隆形成试验是测定单个细胞增值能力的有效方法之一,其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6 次以上,其后代所组成的细胞群体,称为克隆或集落.一般情况,每个克降可含50个以上的细胞,大小在0.3~~I.0mm之间.通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增值潜力做定量分析.常见的方法有平板克隆形成试验,软琼脂形成试验等.这种方法常见于抗肿瘤药物敏感性试验,肿瘤放射生物学试验等.

优点：在低剂量辐射下,克隆形成试验比 MTT和SRB法的敏感性更强.

缺点：较为繁琐并耗l时,不适合同时监测大量样品,而且在手动计数过程中带有非常大的不确定性,特别是当形成的细胞克降大小差异较大时,很难得到更有效,精确的数据.

 三、比色法 

比色法便是利用活细胞还原力，尤其是线粒体中脱氢酶，将底物还原后检测吸光值的改变来衡量活细胞还原力。在对细胞还原力的检测中，培养液中若存在还原酶类，例如谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST），可能会使测定结果偏离,真实水平偏高。目前应用的底物以刃天青盐类和四唑盐类为主，在四唑盐类的底物中尤其以灵敏度高、重复性好、毒性极低的CCK-8受欢迎。下面跟小编一起比较一下这两类底物的优缺点吧！

1. 刃天青（resazurin）

刃天青溶液呈蓝色，通常用作酸碱指示剂（pH3.8橙～6.5深紫）和氧化还原指示剂。在进行细胞活性检测时，刃天青可渗入细胞并被活细胞不可逆地还原为粉红色，同时有红色荧光的试卤灵（resorufin）出现。试卤灵的吸光值或荧光强度与细胞数量、还原能力呈正相关，因此可通过任一参数来评估细胞活性。

2.四唑盐（tetrazolium salts）

四唑盐（表1）是一种人工合成的杂环化合物，它可被活细胞还原生成甲臜（Formazan），不同的四唑盐衍生物作底物会得到不同颜色的甲臜，与试卤灵一样，甲臜的吸光值大小与细胞数量、代谢活性呈正相关，并以此作为细胞活性强弱的指标（图1）。

图1 四唑盐显色原理

表1 四唑盐的类型

以上是本期文章的全部内容，检测细胞活性的方法的优缺点你是不是清楚了？好了，我们下期见。