WB蛋白质的印迹和检测
蛋白质的印迹和检测包括五个步骤：
转膜→封闭→孵育一抗→孵育二抗→蛋白检测（显色）和分析
1、 转膜
蛋白质印迹首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（膜）上，
即转膜。最常用的固相载体（膜）主要是硝酸纤维素（NC）膜和聚偏二氟乙烯（PVDF）
膜。硝酸纤维素（NC）膜与蛋白质之间靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质
的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC 上的小分
子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜与蛋白质
亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋
白结合。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的
不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 μ m 和0.2 μ m 两种规
格的NC 膜。大于20 KD 的蛋白可用0.45 μ m 的膜，小于20 KD 的蛋白就要用0.2
μ m 的膜。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分
子量蛋白的检测。
常用的转膜方式分为半干转和湿转两种。
半干转即将装有凝胶、膜和滤纸的“三明治”的凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲
液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接
作用在膜和凝胶上，所以其转移条件比较严格，但其转移时间短，效率高。
湿转即将装有凝胶、膜和滤纸的“三明治”的凝胶夹层组合卡在转移槽内，垂直
悬浮在缓冲液中，利用与凝胶夹层平行的电极板的高强度电场将蛋白质从凝胶转移至
膜上。其优点是可以对蛋白质进行有效转移，转移时间可适当延长获得更完全的转移，
且可以同时转移几块胶的蛋白质。
2、 封闭
转移成功后的膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结
合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位
点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋
白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是
BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20，缓冲溶液是TBS或PBS。
惰性蛋白质BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或非离子去污剂Tween-20封闭膜上
的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween-20这种非离子型去污剂在乳化
蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。
 封闭剂选择：
a 脱脂奶是最常用的经济配方
b 脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建
议使用BSA。
c 分析磷酸化蛋白须用BSA。脱脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋
白受到影响，因为磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化;也不适用于碱
性磷酸酶(AP)检测系统。
d 如果用辣根过氧化物酶(HRP)检测系统，封闭液不应加叠氮钠(NaN3)，因为叠氮钠
对辣根过氧化物酶（HRP）有灭活作用。
e 如果用二抗抗体是碱性磷酸酶(AP)标记的检测系统，可使用酪蛋白封闭，同时须选
择TBS缓冲溶液，不可使用PBS缓冲溶液，因为PBS缓冲溶液干扰碱性磷酸酶。
3、 孵育一抗
 检测目标蛋白质的特异性一抗抗体和封闭后的膜进行孵育，膜上的目标蛋白质和一
抗抗体发生特异性的结合。
 在免疫印迹实验中，一抗抗体应该提前选定。一抗抗体取决于被检测的抗原蛋白质。
免疫印迹一抗抗体包含单克隆抗体(MAbs)和多克隆抗体(PAbs)。单克隆抗体(MAbs)识别
单个抗原表位,具有更高的特异性,可有效降低背景;但如果所识别的抗原表位被破坏，则
会影响实验结果。 多克隆抗体可识别多个抗原表位，通常具有更高的亲和力，即使有
少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果。 
4、 孵育二抗
 特异性酶标记的针对一抗抗体的二抗抗体和孵育一抗后的膜进行孵育，膜上已和目
标蛋白质特异性的结合的一抗抗体和二抗抗体发生特异性的结合。
 大多数一抗抗体的来源是小鼠或兔，因此抗鼠免疫球蛋白和抗兔免疫球蛋白是最常
见的二抗抗体。山羊是最常见的用于生产多克隆抗小鼠和抗兔抗体的动物，所以山羊抗
鼠免疫球蛋白和抗兔免疫球蛋白是最常见的二抗抗体。选择二抗抗体取决于一抗抗体的
动物来源。例如,如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体,二抗抗体必须是抗小鼠的抗体；如
果一抗抗体是兔来源多克隆抗体,二抗抗体必须是抗兔的抗体。
5、 蛋白检测（显色）和分析
 （1）蛋白检测（显色）：
酶标记的二抗和合适的底物发生反应，生成有颜色的产物，即可见的蛋白区带，
通过分析特异性反应生成的可见蛋白区带的位置和强度即可获得特定蛋白质在所分
析的细胞或（和）组织中表达情况的信息。
 在酶标二抗抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶(HRP)。碱
性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根
过氧化物酶可以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化
成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物
酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，
在化学增强剂存在下光强度可以增大1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可
以检测辣根过氧化物酶的存在。
 （2）结果分析：
a 对照设计
成功进行 Western Blot 检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设
置了这些对照，即可快速和准确的找到 Western Blot 的问题所在，并保证实验结果
的准确性和特异性。
一般需要设置的对照如下：
阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率。
阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性。
二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性。
内参对照：检测标本的质量和二抗系统。
空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。
b 内参
内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的
蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用
它来做参照物。在 Western Blotting 中使用内参其实就是在免疫印迹过程中另外用
内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于
内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校
正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。此外使用内
参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blotting 显色或
者发光体系是否正常。
选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。当目的蛋白的分子
量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显，可同时进行检测；当目的蛋白
的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体检
测，然后使用印迹膜再生液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体检测。
常用内参一览
 常用内参 ECL 发光检测图例
二、Western blotting 实验流程
蛋白抽提
蛋白定量
上样、电泳
染胶 转膜
染膜 封闭
孵育一抗
孵育二抗
化学显色方法检测 化学发光方法检测
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液
SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒
SDS-PAGE 电泳缓冲液