夹心ELISA实验方案

夹心ELISA的一般流程和提示，包括查找匹配抗体对的详细方法。
简介
夹心 ELISA 测定两层抗体（捕获抗体和检测抗体）之间的抗原。目标抗原必须包含至少两个能够结合到抗体的抗原表位。
单克隆或多克隆抗体均可在夹心 ELISA 系统中用作捕获抗体和检测抗体。单克隆抗体识别单一表位，可对抗原中微小差别进行定量检测。多克隆抗体通常用作捕获抗体以沉降尽可能多的抗原。
夹心 ELISA 省去了分析之前的样品纯化步骤，而且提高了分析灵敏度（灵敏度比直接或间接 ELISA 高 2-5 倍）。
一般提示
夹心 ELISA 程序可能难以优化，应使用已测试的匹配抗体对。这样可确保抗体检测靶蛋白上的不同表位，而不会干扰其它抗体结合。我们不能保证我们的抗体可用于夹心 ELISA，除非它们已经过专门的测试。
请查看抗体数据表获取已测试应用的信息。

​用捕获抗体包被
1.       用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH 9.6) 中浓度为 1–10 μg/mL 的捕获抗体包被 PVC 微量滴定板的样品孔。

如果使用未纯化抗体（例如腹水或抗血清），可能需要提高样品蛋白质的浓度（尝试 用10 μg/mL）来补偿较低浓度的特异性抗体。
2.       用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在 4 ℃ 下孵育过夜。
3.       弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μL PBS。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
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封闭和加样
1.       每孔添加 200 μL 封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
2.       用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 1-2 小时，或在 4 ℃ 下孵育过夜。
3.       用 200 µL PBS 洗涤微量滴定板两次。
4.       每孔添加 100 μL 经过稀释的样品。通常将未知样品的信号与标准曲线的信号进行比较。每个板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样。在 37 ℃ 下孵育 90 分钟。

确保标准品的浓度涵盖抗体结合的大部分动态检测范围。可能需要优化浓度范围以确保获得合适的标准曲线。样品和标准品通常采取两重测定或三重测定。
5.       弃去样品，用 200 μL PBS 洗涤微量滴定板两次。

​用检测抗体和二抗孵育
1.       每孔添加 100 μL 经过稀释的检测抗体。

确保检测抗体识别与捕获抗体不同的靶蛋白上的表位。这能避免抗体结合受到干扰。尽可能使用已测试的匹配抗体对。
2.       用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。
3.       用 PBS 洗涤微量滴定板四次。
4.       添加 100 μL 偶联二抗，其在使用之前便用封闭缓冲液进行稀释。
5.       用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 1-2 h。
6.       用 PBS 洗涤微量滴定板四次。

​​检测
辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 分析中使用最广泛的两种酶。
要考虑到某些生物材料具有高水平的内源酶活性（例如肺泡细胞中的高水平 ALP、红细胞中的高水平过氧化物酶），这可能会导致非特异性信号。如有必要，用左旋咪唑（针对 ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（针对过氧化物酶）进行另外的阻断处理。
ALP 底物
对硝基苯磷酸盐 (pNPP) 是大多数应用中广泛使用的底物。在室温下孵育 15-30 分钟后，在 405 nm 处测定硝基苯酚呈现的黄色，加入等体积的 0.75 M NaOH 可终止反应。
HRP 显色液
HRP 的底物为过氧化氢。过氧化氢的裂解与氢供体的氧化偶联，反应期间氢供体的氧化使颜色发生变化。
TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）
每孔添加 TMB 溶液，孵育 15–30 分钟，添加等体积的终止液 (2 M H2SO4)，然后在 450 nm 处读取光密度。
OPD（邻苯二胺二盐酸盐）
在 492 nm 处测定终产物。底物对光敏感，应避光保存。
ABTS（2,2'-联氮-双-[3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐）
终产物为绿色，可在 416 nm 处测定光密度。
某些酶底物被认为是有害的（潜在致癌物），因此始终要小心处理并佩戴手套。
​数据分析
利用系列稀释液数据绘制标准曲线，其中 X 轴（对数标度）为浓度，Y 轴（线性标度）为吸光度。通过内插法在此标准曲线得出样品浓度。