线虫unc-22突变基因的克隆

实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg² 、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。

实验试剂

1. Taq DNA聚合酶

2. 安苄青霉素

3. 葡萄糖

4. X-gal

5. IPTG

6. pMD18-T载体

7. LB培养基

8. 溶液I、溶液II、溶液III

9. 苯酚

10. 

11. 95%乙醇

12. 无水乙醇

13. RNAase A

14. DNA Marker

实验设备

1. 培养皿

2. 涂玻棒

3. 移液枪

4. 枪头

5. 1.5ml离心管

6. PCR 管

7. PCR仪

8. 恒温培养箱

9. 恒温摇床

10. 恒温水浴锅

11. 离心机

12. 无菌操作台

实验步骤

1. 引物设计

从NCBI上下载线虫unc-22基因序列（GenBank登录号：NM_069873），依照此序列用 Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。

2. 目的基因片段的PCR扩增

25µl反应体系：

模板cDNA 1.5µl

10×reaction buffer 2.5µl

2.5mM MgCl₂ 2µl

2.5mM dNTP 2µl

上游引物 1µl

下游引物 1µl

Taq DNA聚合酶 0.2µl

加ddH₂O至总体积 25µl

按照以下程序进行PCR扩增：

94℃预变性4min；

94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；

72℃总延伸10min，4℃保存。

取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。

3. 目的基因片段PCR产物的纯化回收

将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。

4. 目的基因片段与克隆载体的连接

PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：

纯化回收的PCR产物 4μl

Ligation SolutionⅠ 5μl

pMD18-T Vector DNA 1μl

混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。

5. 连接产物的转化

   1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；

   2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；

   3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；

   4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；

   5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、 4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；

   6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
6. 重组质粒的筛选

分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl 氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：

   1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；

   2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；

   3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；

   4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；

   5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；

   6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和，轻轻摇匀，静置2分钟；

   7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；

   8) 加入400μl摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；

   9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；

   10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；

   11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。

7. 重组质粒的测序验证