PCR扩增产物鉴定与纯化

实验原理

实验试剂

实验设备

实验材料

实验步骤

1. 使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。（参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验）

2. 在紫外灯下切出含有目的DNA（约600bp）的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

     注意：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。

3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。

4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1µL进行计算。

5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表：

 

凝胶浓度	DR-I Buffer 使用量
1%	3个凝胶体积量
1%-1.5%	4个凝胶体积量
1.5%-2%	5个凝胶体积量

 

6. 均匀混合后75℃加热，融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6～10分钟）。

     注意：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。

7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。

8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1min，弃滤液。

     注意：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

10. 将500 µL的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30s，弃滤液。

11. 将700 µL的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm离心30s，弃滤液。

12. 重复操作步骤11。

13. 将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 µL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。

     注意：使用加热至60℃的灭菌蒸馏水或Elution Buffer有利于提高洗脱效率。

14. 12000 rpm离心1min洗脱DNA。

                 -20℃低温保存纯化的目的DNA片段。