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KAI1/CD82通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肾癌发生发展机制的研究（信裕生物文献）
人阅读 发布时间：2018-07-02 17:05
KAI1/CD82通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肾癌发生发展机制的研究
背景肾细胞癌起源于肾近曲小管上皮细胞,是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,在成人恶性肿瘤中约占3%。在不同病理类型肾脏恶性肿瘤中肾透明细胞癌最为常见,约占肾癌的70%,与其他类型的肾癌相比,临床症状更明显,转移率更高。肾癌在不同国家和地区的发病率不尽相同,肾癌的发病率分布同当地经济密切相关,一般来说经济发达地区要高于经济欠发达地区。肾癌在不同年龄段均可发病,但是高发期一般是50-70岁,年龄越小,发病率越低。肾癌在性别中也有一定差异,男女患者发病率比例约为2:1。由于人们生活水平的提高,饮食结构的改变以及生活环境的改变,肾癌的发病率呈明显增高趋势。早中期肾癌主要利用手术治疗,但仍有1/3肾癌患者属于晚期,对放化疗及免疫治疗不敏感。KAI1基因(Kang Ai 1),由Dong等科学家在1995年发现的特异性抑制肿瘤转移的基因,该基因是从转移到AT6.1细胞系中的人第11号染色体中分离得到的,可以表达CD82蛋白。KAI1/CD82是四穿膜超家族(Transmembrane 4 Superfamily,TM4SF)的成员之一,TM4SF成员的结构和功能都很相似,其本质上为细胞膜糖蛋白。TM4SF拥有四个跨膜区,每个跨膜区上含有具有极性的氨基酸,这些氨基酸高度保守,决定了TM4SF在肿瘤细胞的恶性生物学行为中起到重要的调控作用。KAI1/CD82作为TM4SF成员之一,已有研究证实其与调节细胞黏附相关。KAI1/CD82在前列腺癌、肺癌、膀胱癌、食管癌、原发性黑色素瘤、结直肠癌、胃癌、宫颈癌和鼻咽癌等恶性肿瘤中作为癌基因的负性调节基因均已被证实。Lu等学者发现在肾透明细胞癌细胞系786-0中KAI1/CD82可以稳定表达,并且786-0细胞的黏附性、增殖性和侵袭性等生物学行为都受到KAI1/CD82的调节。β-catenin是一种重要胞质蛋白,最初是作为粘附因子被发现,可参与细胞间粘附的调控。β-catenin作为Wnt信号通路的重要下游信号分子,从胞质聚集到细胞核后可以与细胞核内的TCF/LEF转录因子结合,形成复合物调节下游靶基因的表达,从而参与细胞增殖的调控促进转录。Wnt蛋白可以和细胞表面的Frizzled受体结合,使Dishevelled(DSH)等受体蛋白激活,抑制下游蛋白质复合物,包括Axin、GSK-3β与APC蛋白等,而Axin/GSK-3β/APC蛋白复合体可以使信号分子β-catenin磷酸化而降解。因此Wnt信号通路被激活后可以抑制β-catenin降解,使胞浆内的β-catenin的浓度增加并向核内转移,与TCF/LEF转录因子家族作用并促进特定基因的表达。下游靶基因的异常表达使细胞增殖增快,引起蛋白质异常表达,导致细胞癌变加速。因此我们推测,KAI1/CD82可抑制肾细胞癌的发生和进展,其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路来发挥作用,本课题组通过敲低KAI1的PLTHR-shKAI1质粒转染786-0和OSRC细胞系来探讨其分子机制。目的通过肾癌标本及786-0和OSRC肾癌细胞系,探究KAI1/CD82对肾癌细胞恶性生物学行为的影响作用,并探讨KAI1/CD82通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肾癌发生发展的分子机制。方法1.免疫组化和Western blot分别检测肾癌及癌旁组织中CD82及β-catenin蛋白的表达情况。2.提取PLTHR-shKAI1和PLTHR-Vector质粒,顺转786-0和OSRC肾癌细胞系。3.PLTHR-shKAI1/PLTHR-Vector与eGFP-C1质粒共转染786-0细胞系和OSRC细胞系,在荧光显微镜下观察两种细胞的转染效率。4.Western blot检测PLTHR-shKAI1质粒对786-0和OSRC中KAI1/CD82蛋白表达的影响。5.细胞划痕实验(Wound healing assay)、细胞增殖实验(CCK-8法)和细胞侵袭实验(Transwell invasion assay)检测敲低KAI1对786-0和OSRC肾癌细胞系迁移、增殖、侵袭的影响。6.Western blot检测沉默KAI1后786-0和OSRC肾癌细胞系中Wnt通路相关蛋白β-catenin、Axin2和GSK-3β表达情况,探讨分子机制。结果1.KAI1/CD82在肾癌组织中蛋白表达量低于癌旁组织;β-catenin在肾癌组织中蛋白表达量高于癌旁组织。2.786-0和OSRC细胞的转染效率较高。3.PLTHR-shKAI1质粒转染786-0和OSRC后可使KAI1/CD82表达沉默。4.敲低KAI1/CD82后可使786-0和OSRC肾癌细胞系迁移、增殖和侵袭能力增强。5.敲低KAI1/CD82后可使786-0和OSRC细胞中β-catenin表达量增高,Axin2、GSK-3β表达量则降低.结论KAI1/CD82在肾癌组织中蛋白表达量低于癌旁组织;β-catenin在肾癌组织中蛋白表达量高于癌旁组织。KAI1可抑制肾癌细胞的迁移、增殖和侵袭。KAI1通过Wnt/β-catenin信号通路对肾癌发生发展起抑制作用。
背景肾细胞癌起源于肾近曲小管上皮细胞,是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,在成人恶性肿瘤中约占3%。在不同病理类型肾脏恶性肿瘤中肾透明细胞癌最为常见,约占肾癌的70%,与其他类型的肾癌相比,临床症状更明显,转移率更高。肾癌在不同国家和地区的发病率不尽相同,肾癌的发病率分布同当地经济密切相关,一般来说经济发达地区要高于经济欠发达地区。肾癌在不同年龄段均可发病,但是高发期一般是50-70岁,年龄越小,发病率越低。肾癌在性别中也有一定差异,男女患者发病率比例约为2:1。由于人们生活水平的提高,饮食结构的改变以及生活环境的改变,肾癌的发病率呈明显增高趋势。早中期肾癌主要利用手术治疗,但仍有1/3肾癌患者属于晚期,对放化疗及免疫治疗不敏感。KAI1基因(Kang Ai 1),由Dong等科学家在1995年发现的特异性抑制肿瘤转移的基因,该基因是从转移到AT6.1细胞系中的人第11号染色体中分离得到的,可以表达CD82蛋白。KAI1/CD82是四穿膜超家族(Transmembrane 4 Superfamily,TM4SF)的成员之一,TM4SF成员的结构和功能都很相似,其本质上为细胞膜糖蛋白。TM4SF拥有四个跨膜区,每个跨膜区上含有具有极性的氨基酸,这些氨基酸高度保守,决定了TM4SF在肿瘤细胞的恶性生物学行为中起到重要的调控作用。KAI1/CD82作为TM4SF成员之一,已有研究证实其与调节细胞黏附相关。KAI1/CD82在前列腺癌、肺癌、膀胱癌、食管癌、原发性黑色素瘤、结直肠癌、胃癌、宫颈癌和鼻咽癌等恶性肿瘤中作为癌基因的负性调节基因均已被证实。Lu等学者发现在肾透明细胞癌细胞系786-0中KAI1/CD82可以稳定表达,并且786-0细胞的黏附性、增殖性和侵袭性等生物学行为都受到KAI1/CD82的调节。β-catenin是一种重要胞质蛋白,最初是作为粘附因子被发现,可参与细胞间粘附的调控。β-catenin作为Wnt信号通路的重要下游信号分子,从胞质聚集到细胞核后可以与细胞核内的TCF/LEF转录因子结合,形成复合物调节下游靶基因的表达,从而参与细胞增殖的调控促进转录。Wnt蛋白可以和细胞表面的Frizzled受体结合,使Dishevelled(DSH)等受体蛋白激活,抑制下游蛋白质复合物,包括Axin、GSK-3β与APC蛋白等,而Axin/GSK-3β/APC蛋白复合体可以使信号分子β-catenin磷酸化而降解。因此Wnt信号通路被激活后可以抑制β-catenin降解,使胞浆内的β-catenin的浓度增加并向核内转移,与TCF/LEF转录因子家族作用并促进特定基因的表达。下游靶基因的异常表达使细胞增殖增快,引起蛋白质异常表达,导致细胞癌变加速。因此我们推测,KAI1/CD82可抑制肾细胞癌的发生和进展,其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路来发挥作用,本课题组通过敲低KAI1的PLTHR-shKAI1质粒转染786-0和OSRC细胞系来探讨其分子机制。目的通过肾癌标本及786-0和OSRC肾癌细胞系,探究KAI1/CD82对肾癌细胞恶性生物学行为的影响作用,并探讨KAI1/CD82通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肾癌发生发展的分子机制。方法1.免疫组化和Western blot分别检测肾癌及癌旁组织中CD82及β-catenin蛋白的表达情况。2.提取PLTHR-shKAI1和PLTHR-Vector质粒,顺转786-0和OSRC肾癌细胞系。3.PLTHR-shKAI1/PLTHR-Vector与eGFP-C1质粒共转染786-0细胞系和OSRC细胞系,在荧光显微镜下观察两种细胞的转染效率。4.Western blot检测PLTHR-shKAI1质粒对786-0和OSRC中KAI1/CD82蛋白表达的影响。5.细胞划痕实验(Wound healing assay)、细胞增殖实验(CCK-8法)和细胞侵袭实验(Transwell invasion assay)检测敲低KAI1对786-0和OSRC肾癌细胞系迁移、增殖、侵袭的影响。6.Western blot检测沉默KAI1后786-0和OSRC肾癌细胞系中Wnt通路相关蛋白β-catenin、Axin2和GSK-3β表达情况,探讨分子机制。结果1.KAI1/CD82在肾癌组织中蛋白表达量低于癌旁组织;β-catenin在肾癌组织中蛋白表达量高于癌旁组织。2.786-0和OSRC细胞的转染效率较高。3.PLTHR-shKAI1质粒转染786-0和OSRC后可使KAI1/CD82表达沉默。4.敲低KAI1/CD82后可使786-0和OSRC肾癌细胞系迁移、增殖和侵袭能力增强。5.敲低KAI1/CD82后可使786-0和OSRC细胞中β-catenin表达量增高,Axin2、GSK-3β表达量则降低.结论KAI1/CD82在肾癌组织中蛋白表达量低于癌旁组织;β-catenin在肾癌组织中蛋白表达量高于癌旁组织。KAI1可抑制肾癌细胞的迁移、增殖和侵袭。KAI1通过Wnt/β-catenin信号通路对肾癌发生发展起抑制作用。
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