背景和目的:由于环境及生活方式的改变,肺癌的发生率逐年升高,目前已成为全世界急需攻克的难题。大部分患者在就诊时已处于进展期,使肺癌的五年生存率处于低水平。因此,我们急切寻找更多治疗肺癌的有效药物。近几年天然产品氯化两面针碱被认为具有抗肿瘤作用。已有多项实验证明氯化两面针碱对乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌等细胞具有抑制增殖作用,但尚未见对肺癌细胞作用的研究。本实验以肺癌A549细胞为研究对象,观察氯化两面针碱对其抑制作用并讨论相关机制。1.观察氯化两面针碱对人肺癌细胞生长和增殖的影响;2.观察氯化两面针碱对人肺癌细胞凋亡及细胞周期的影响,并探讨其机制。方法:1.不同浓度的氯化两面针碱作用于A549细胞,体外培养48h后,应用MTT法检测A549细胞的生长和增殖情况;2.不同浓度的氯化两面针碱作用于A549细胞后,应用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态学变化;应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率,PI单染法检测各组细胞周期比例;应用Western blot方法检测各组细胞凋亡通路、Wnt通路及细胞周期相关分子的表达情况。结果:1.MTT结果显示,氯化两面针碱显著抑制A549细胞的增殖,其抑制增殖作用呈时间和剂量依赖性。单因素方差分析,各时间段内实验组与对照组比较,差异有统计学意义(**P<0.05,***P<0.01);2.应用Hoechst33258染色法,可见经氯化两面针碱处理过的A549细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状、块状荧光,形成大小不等、内含细胞器和细胞核的凋亡小体;3.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测结果显示,不同浓度的氯化两面针碱对A549细胞具有诱导凋亡作用,与对照组相比,差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01);4.PI单染法结果显示,经氯化两面针碱处理后的A549细胞,G2/M期细胞显著增多,呈剂量依赖性,提示氯化两面针碱具有阻滞细胞周期的作用;5.Western blot检测结果显示,随着氯化两面针碱浓度的升高,A549细胞的凋亡通路相关分子Bcl-xl、Bid、PARP、p-β-catenin的表达水平下调;Cyto-C、β-catenin的表达水平上调;Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8活性增强。提示氯化两面针碱能诱导A549细胞凋亡,呈剂量依赖性。细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达水平逐渐下调。提示氯化两面针碱可阻滞细胞周期,呈剂量依赖性。结论:1.氯化两面针碱可抑制肺癌A549细胞的生长和增殖;2.氯化两面针碱可通过线粒体通路和死亡受体通路诱导肺癌A549细胞的凋亡,可能有Wnt/β-catenin信号转导通路的参与,并受Bcl-2蛋白家族的调节;3.氯化两面针碱可阻滞肺癌A549细胞于G2/M期。

文内图片：

MTT法检测氯化两面针碱对A549细胞的增殖抑制效应

氯化两面针碱处理后A549细胞的形态学改变

氯化两面针碱对A549细胞凋亡的影响

氯化两面针碱对A549细胞周期分布的影响

Westernblot方法检测凋亡通路相关分子的表达

Westernblot法检测Wnt通路及细胞周期相关分子的表达

氯化两面针碱结构式