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免疫学检测法

发布时间:2020-06-11 17:57 |  点击次数:

免疫学检测法

免疫学检测法的基本原理是细胞因子(或受体)与相应的特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)结合,通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示,从而定性或定量显示细胞因子(或受体)的水平。这类方法的优点是实验周期短,少受抑制物或相似生物池功能因子的干扰,如抗体的特异性高可区分不同型或亚型的细胞因子(如IFN),一次能检测大量标本,易标准化。与生物学活性检测方法相比,免疫学检测法在许多情况下敏感性低于前者,所得结果不表示生物学活性,有的McAb只能识别重组的细胞因子,在检测天然的细胞因子中受到限制。

免疫学检测的方法多采用ELISA和RIA法,可以分为平心法、竞争法和间接法。

(一)ELISA(或RIA)平心法

根据抗体性质和特异性不同可有以下几种不同的平心法ILISA。

1.PcAb与McAb夹心法 用纯化的多克隆抗体(PcAb)包被板子,加待检细胞因子(或可溶性受体)和标准品,上层加酶标记的McAb。有时为了增加敏感性,上层加McAb后再用酶标记第二抗体显色。

2.McAb与PcAb夹心法 用McAb包被板子,加待检样品,上层加酶标记的PcAb。有时为了增加敏感性,上层加PcAb后再用钊对PcAb的酶标记抗抗体。

3.双McAb夹心法 选择和应用识别同一个细胞因子(或受体)分子上不同表位的两种McAb,其中一种包被板子,另一种McAb标记酶。由于单克隆抗体亲和力识别表位地匀一,从质量控制角度来看,一般比上两种夹心法易控制。如目前已商品化检测细胞因子(或其受体)的检测盒大多采用双单克隆抗体夹心法。

4.细胞、McAb夹心法 用表达IL-2R的MT-1细胞包被板子,加入待检IL-2或标准品,上层加125I标记的McAb,根据γ计数cpm值推算出待检IL-2含量。

(二)竞争法

有报道用况争法检测IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子,同时加入125I标记的IL-2和待测IL-2,根据γ计数cpm值得知待检IL-2对125I-IL-2与PcAb竞争结合的程度,从而推算出待测标本IL-2的含量。这种方法检测IL-2的敏感性可达50pg/ml。

为了增加敏感性,在上述系统中可再连接上生物素,再用链霉亲和素(streptavidin)酶标记物进行放大。此外,还可用化学发光、改进显色底物等措施提高检测方法的敏感性。

表4-23 细胞因子生物学活性与免疫学检测方法的比较

 

  生物学活性法 免疫学检测法
原理 细胞因子特定的 细胞因子与相应抗体
  生物学活性 特异性结合反应
结果表示 生物学活性水平 含 量
敏感性 一般较高 一般较低
  (与细胞表面高亲和力受体有关) (加放大系统可明显升高)
特异性
(识别类型、亚型) (不能) (不可能)
周 期 较 长
受实验条件影响    
培养条件
指示细胞敏感性差异
指示细胞突变 可发生
生物学作用相同因子干扰
样品中特异性或非特异性
抑制物干扰    
重复性 较 差 较 好
标准化、大量检测 困 难 容 易